Korean J Fam Pract 2021; 11(4): 312-321  https://doi.org/10.21215/kjfp.2021.11.4.312
Recurrent Neural Network Based Drug Repurposing to Address SARS-CoV-2 (COVID-19), and the in vitro Antiviral Efficacy of Peroxisome Proliferator-Activated Receptors-Gamma Agonist
Nam Hee Kim, Jae June Dong*
Department of Family Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea
Jae June Dong
Tel: +82-2-2019-3484, Fax: +82-2-2019-3484
E-mail: s82tonight@yuhs.ac
ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2420-2155
Received: June 18, 2021; Accepted: July 13, 2021; Published online: August 20, 2021.
© The Korean Academy of Family Medicine. All rights reserved.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted noncommercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract
Background: Acute respiratory distress syndrome resulting from coronavirus (COVID-19) infection is triggered by cytokine storms, so activation of inhibitory modulators of inflammatory pathways has become a new candidate modality for COVID-19 treatment. This study utilized artificial intelligence (A.I.) to search databases, and compiled a list of 50 drugs deemed plausible candidates for COVID-19 treatment. We then designed a cellbased in vitro assay to evaluate the efficacy of PPAR-γ agonists against viral induced inflammation.
Methods: We applied RNN screening to Drugbank and CORD-19 databases, and selected as the top 50 drug candidates those compounds that have the highest docking energy with the main protease produced by SARS-CoV-2 infected cells. We then designed an in vitro study including chloroquine, lopinavir, and remdesivir treated cells as controls, and cells treated with two PPAR-γ agonists as experimental groups. SARS-CoV-2 infected cells were administered a range of concentrations of each drug, and inhibition-normalized infection ratios were derived using an immunofluorescence method.
Results: The positive control groups’ SI’s were >1 (chloroquine SI=9.28, remdesivir SI=4.56, lopinavir SI=3.5), confirming their inhibitory effects against SARS-CoV-2 infection. However, chloroquine and lopinavir displayed high cytotoxicity, and Remdesivir displayed low cytotoxicity. The two PPAR-γ agonist SIs indicated that they possess no inhibitory effect against SARS-CoV-2 infection, but are clinically safe.
Conclusion: The PPAR-γ agonists did not reduce numbers of SARS-CoV-2 infected cells. Nevertheless, this study has significance in that we introduced the use of A.I. for rapid new drug development during the COVID pandemic.
Keywords: COVID-19; Artificial Intelligence; Peroxisome Proliferator-Activated Receptors; in vitro
서 론

Coronavirus disease 2019 (COVID-19)는 coronaviridae에 속하는 RNA virus로 병원체는 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)이다(Figure 1). 이 바이러스는 감염자의 비말을 통해 전파되어 감염 시 경증에서 중증까지 다양한 호흡기 감염증이 나타나며 폐렴 및 급성 호흡곤란 증후군으로 진행할 수 있다.1) 급성 호흡곤란 증후군은 사이토카인 폭풍에 의해 촉발되며 다발성 장기부전, 패혈성 쇼크 등으로 악화될 수 있다. 사이토카인 폭풍은 염증성 사이토카인의 비정상적인 과다 생산에 의해 발생하는데 이는 인플루엔자 감염으로 인한 폐의 중증 손상을 일으키는 치명적인 매개자로 알려져 있으며, COVID-19에서도 같은 작용을 할 것으로 예상된다.2) 따라서 과활성화된 염증성 사이토카인을 억제하는 면역 조절자를 활성화하여 사이토카인 폭풍을 억제하는 방법이 새로운 COVID-19 치료제로 떠오르고 있다.3)

Figure 1. Exposure of cell membrane protein of SARS-CoV-2 infected cell and replication of SARS-CoV-2 infection. S1, spike 1; S2, spike 2; ER, endoplasmic reticulum; N, nucleocapsid; S, spike; E, envelope; M, membrane.

기존 신약개발에는 수년 이상의 시간이 소요되는 단점이 있어, 현재와 같은 신종 전염병의 세계적 유행(pandemic) 사태에 인공지능을 활용하여 신약 개발에 소요되는 시간을 줄이고자 하는 시도가 많이 진행되고 있다. 본연구에서는 COVID-19 치료제를 선정하기 위해 공개 database인 Pubchem (약 1억 1천만개의 화합물), Drugbank (약 59,000여종 약물 정보), COVID-19 Open Research Dataset (COVID-19 치료에 임상시험 진입 혹은 진입 대기중인 400여종의 약물에 관한 database)를 활용하여 약물 구조 기반의 인공 지능 분류 모델을 사용하였다.4-6) Pubchem에 등록되어 있는 화합물을 대상으로 분류처리속도를 향상시키기 위해 1차원 약물 구조 표현 모델인 simplified molecular-input line-entry system (SMILEs)을 입력 값으로 하여 recurrent neural network (RNN) 기법을 이용해 스크리닝을 진행하였다(Figure 2).7)

Figure 2. Process of data conversion by simplified molecular-input line-entry system (SMILES). EOS, end of stream; LSTM, long short term memory.

위와 같은 스크리닝 과정을 거쳐 Peroxisome proliferator-activated receptors gamma agonist 2종을 선정하여 COVID-19 치료 효과를 증명하기 위한 세포 실험을 계획하였다.8) Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs)은 alpha, delta/beta, gamma 세 개의 동형 핵 수용체로 이루어진 핵 전사체 그룹으로 peroxisome proliferator-activated receptors response element에 결합하여 특정 유전자의 전사를 억제한다. PPAR-γ는 염증반응시 대식세포에서 분비되는 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β 등의 유전자 전사를 억제하여 염증 반응을 감소시킨다.9) 그 예로 PPAR-γ가 인플루엔자 A, RSV 감염 시 폐 실질에서 일어나는 대식세포의 염증 반응을 억제하여 폐렴의 회복을 촉진하는 것을 2019년 발표된 논문에서 증명하였다.10)

본 논문에서는 PPAR-γ agonist의 항염증 메커니즘에 착안하여, SARS-CoV-2에 대한 PPAR-γ agonist 화합물의 항바이러스 효과를 평가하는 세포 실험을 설계하였다. SARS-CoV-2 감염 세포에 상기 화합물 및 기준 화합물을 처리하여 각 화합물의 바이러스 감염 저해 효과를 면역형광법을 이용하여 용량반응곡선(dose response curve; DRC) 실험으로 도출하였다.

방 법

1. 바이러스 및 세포주

COVID-19 감염 세포주인 Vero 세포는 ATCC (ATCC-CCL81)로부터 구입하여 배양하였고 감염원인 SARS-CoV-2는 한국질병관리본부(KCDC)에서 제공받았다.

2. 인공지능을 이용한 화합물의 선정

Pubchem과 Drugbank에 등록되어 있는 화합물을 SMILEs를 입력 값으로 하여 RNN 기법을 이용해 스크리닝하여 일반 화합물과 의료 화합물의 차이점을 분석하여 학습한 1차 사전학습모델(pre-trained model)을 개발하였다.11) 이를 CORD-19 (COVID-19 Open Research Dataset)에 등록되어 있는 400여 종의 약물과 Drugbank에 등록되어 있는 약물에 적용하여 2차 전이학습(fine tuning)을 시행하였다.12) Antudock vina를 이용해 화합물과 SARS-CoV-2 감염 세포에서 발현되는 main protease 사이의 docking simulation을 시행하여 결합 에너지 값이 큰 상위 50개의 약물을 선정하였고, PPAR-γ agonist의 2종이 포함되었다(Figure 3).

Figure 3. Molecular docking simulation between SARS-CoV-2 main protease and RNA-dependent RNA polymerase using autodock vina. (A) Binding site of SARS-CoV-2 main protease. (B) Binding site of RNA-dependent RNA polymerase.

3. 세포 실험의 설계

PPAR-γ agonist의 효과를 비교하기 위해 기존에 COVID-19에 치료 효과가 있다고 알려진 chloroquine과 lopinavir, remdesivir를 기준 화합물로 이용하였으며 시약은 각각 Sigma-Aldrich, SelleckChem, MedChemExpress에서 구입하였다.13) SARS-CoV-2 감염 세포에서 발현되는 단백질에 결합하는 Anti-SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) 항체를 처리하여 세포의 감염 유무 및 바이러스 발현 억제도를 계산하였으며 nucleocapsid에 결합하는 1차 항체는 Sino Biological, 2차 항체인 Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG와 Hoechst 33342는 Molecular Probes에서 구입하였다.

384-조직배양 plate에 well당 1.2×104개의 Vero 세포를 배양하였다. 배양 24시간 후, 각 화합물을 DMSO에 2배 연속 희석하여 10포인트씩 최대 50 μM을 최고 농도로 하여 세포에 처리하였다. Chloroquine은 충분한 효과를 얻기 위해 예외적으로 150 μM까지의 농도로 처리하였다. 화합물 처리 약 1시간 후, 세포에 SARS-CoV-2 (0.0125 Mole)를 감염시키고 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 4% paraformaldehyde로 세포를 고정하여 투과성을 확립하였다. 그 후 anti-SARS-CoV-2 nucleocapsid (N) 1차 항체를 처리하고, Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG 2차 항체와 Hoechst 33342를 처리하여 세포를 면역 형광 염색하였다.

4. 면역 형광법에 의한 이미지 분석 및 용량반응곡선 분석

감염 세포의 형광 이미지는 대용량 이미지 분석 기기인 Operetta (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 획득하였고 이미지 분석은 Columbus 소프트웨어를 이용하였다. Well당 총 세포수는 Hoechst로 염색된 핵의 개수로 산출하였고, 감염된 세포수는 SARS-CoV-2 nucleocapsid (N)를 발현하는 세포수로 산출하였다. 감염도(infection ratio)는 N 단백질을 발현하는 세포수/총 세포수로 계산하였다. 각 well당 감염도는 동일한 plate에서 감염되지 않은 세포를 포함한 well의 평균 감염도와 0.5% DMSO가 처리된 감염세포를 포함한 well들의 평균 감염도로 표준화하였다. 화합물의 세포 독성은 각 well의 세포수를 감염되지 않은 세포 그룹 well의 평균 세포수로 표준화하여 그래프에 ‘cell number to mock’으로 표기하였다. IC50은 전체 세포의 50%가 반응을 나타내는 약물의 농도, CC50은 전체 세포의 50%에서 세포 독성이 나타나는 약물의 농도이며, 약물 농도에 따른 반응 곡선과 IC50, CC50 값은 XLFit 4 (IDBS) 소프트웨어의 Y=Bottom+(Top-Bottom)/(1+(IC50/X)Hillslope) 수식을 활용해 도출하였다. 모든 IC50, CC50 값은 두 번의 반복 실험을 거쳐 얻은 결과로 적합용량반응곡선(fitted dose-response curve)에 대입하여 산출하였고, 선택 지수(selectivity index; SI) 값은 CC50/IC50으로 계산하였다.

결 과

1. RNN (Recurrent Neural Network) 기법을 이용해 도출한 COVID-19 치료제의 선정

RNN 기법으로 산출된 약물 중 vina score의 절대값이 7 이상을 기준으로 약물을 선정하였고, 결합 에너지 값이 클수록 치료 효과가 높을 것이라 판단하였다. PPAR-γ agonist는 현재 임상에서 혈당강하제로 사용되고 있는 thiazolidinediones의 구조물로 안정성이 확립되어 있어 치료 효과가 확인될 경우 빠르게 임상 적용이 가능하다는 장점이 있어 실험군으로 선정되었다(Figure 4).14) 실험에 사용한 2가지 PPAR-γ agonist의 vina score는 각각 GSK-376501가 -6.8, 2-{5-[3-(6-BENZOYL-1-PROPYLNAPHTHALEN-2-YLOXY)PROPOXY]INDOL-1-YL}ETHANOIC ACID가 -7.8이다. Autodock vina의 docking energy 값의 신뢰도를 확인하기 위해 다른 docking tool인 GOLD를 이용해 CHEMPLP score를 함께 계산하였다(Appendix 1).

Figure 4. Chemical structure of peroxisome proliferator-activated receptors-gamma agonist. (A) GSK-376501 (DB12654). (B) 2-{5-[3-(6-BENZOYL-1-PROPYLNAPHTHALEN-2-YLOXY)PROPOXY]INDOL-1-YL}ETHANOIC ACID (DB04689).

2. 세포 실험을 이용한 화합물의 용량반응곡선(DRC) 분석

SARS-CoV-2 감염 세포에 5가지의 화합물을 처리하였으며 각 화합물의 농도별 SARS-CoV-2 감염저해율(inhibition-normalized infection ratio) 및 표준화한 세포독성(cell number to mock), IC50, CC50, SI 값은 다음 표와 같다(Tables 1, 2). 실험 결과 값을 용량반응곡선으로 도식화하였으며, 파란색 그래프는 해당 화합물의 SARS-CoV-2의 감염저해율을 나타내며, 붉은색 그래프는 해당 화합물의 세포독성을 의미한다(Figure 5). 선택 지수(SI) 값은 CC50/IC50으로 계산하였고 선택지수가 1 이상일 때 해당 화합물이 효과가 있는 것으로 판단하였다. PPAR-γ agonist의 효과를 비교하기 위해 선정된 기준 화합물인 chloroquine (SI=9.28), remdesivir (SI=4.56), lopinavir (SI=3.5) 모두 SARS-CoV-2 감염 저해 효과가 있는 것으로 확인되었다. Chloroquine은 기준 화합물 중에서 SI 값이 가장 높지만 SARS-CoV-2 감염 저해 효과가 보이는 농도에서 CC50 값이 크게 증가하여 세포독성이 높아 실제 임상에서 사용하기에 부적합한 약물로 판단된다. Lopinavir는 SI 값이 1 이상으로 SARS-CoV-2 감염 저해에 효과적이나 CC50 값이 높아 chloroquine과 마찬가지로 임상 적용에는 제한적이다. 반면 실제 COVID-19 치료제로 사용중인 remdesivir의 경우 SI=4.56으로 바이러스 감염 저해 효과가 높으면서 적정 치료 약물 농도에서 CC50 값이 증가하지 않아 임상적으로 사용하기에 안정적인 약물임을 확인할 수 있었다.

Table 1

Inhibition effect of SARS-CoV-2 and survival cell ratio by concentration in comparison group

SubstanceConcentration
(µM)
Inhibition-normalized infection ratioCell number to mock (%)IC50CC50SI
1st2nd1st2nd
Chloroquine150.00100.1999.062.002.349.3887.049.28
75.0099.75100.1978.2478.12
37.50100.1699.8791.3290.90
18.7599.8498.0597.6398.61
9.3842.7755.7799.33102.68
4.693.456.6595.4995.49
2.34-0.411.7095.0294.94
1.17-0.26-0.3693.6494.33
0.590.230.1596.1093.39
0.29-0.31-1.6094.7792.36
Remdesivir50.0098.0898.04105.93107.8810.96>504.56
25.0091.6296.11107.21107.78
12.5061.2863.00106.05105.44
6.2512.278.18104.5399.62
3.132.636.0597.6898.74
1.560.692.5197.3398.93
0.780.612.7698.3498.24
0.391.502.3698.0093.02
0.202.970.1899.6798.42
0.10-0.831.2697.8398.59
Lopinavir50.00100.19100.1450.5552.0314.27>503.50
25.00100.13100.1986.3082.65
12.504.7412.5589.9788.78
6.25-1.761.0994.8990.31
3.130.240.1496.7792.41
1.56-0.40-0.2795.6694.55
0.78-0.190.9993.4797.55
0.39-0.580.2291.5994.82
0.201.630.6394.2390.85
0.100.590.1294.2391.57

IC, inhibitory concentration; CC, cytotoxic concentration; SI, selectivity index.


Table 2

Inhibition effect of SARS-CoV-2 and survival cell ratio by concentration in experimental group

SubstanceConcentration
(µM)
Inhibition-normalized infection ratioCell number to mock (%)IC50CC50SI
1st2nd1st2nd
PPAR-γ agonist-150.000.07-0.36101.20101.37>50>501.0
25.00-1.421.80101.18101.57
12.50-1.272.14102.75102.43
6.250.331.29104.1199.55
3.131.850.29101.0098.76
1.561.090.41103.8198.93
0.780.02-0.22103.1296.27
0.391.161.26100.88101.20
0.201.03-0.52100.12101.42
0.100.82-0.93102.26100.86
PPAR-γ agonist-250.003.1913.50102.75108.47>50>501.0
25.001.573.98106.69104.77
12.503.004.83107.19108.02
6.250.563.59106.33109.06
3.130.865.18105.61105.93
1.562.341.92106.87107.80
0.784.014.17109.95107.04
0.391.151.46106.69105.91
0.202.760.50105.49107.14

PPAR-γ, peroxisome proliferator-activated receptors-gamma; IC, inhibitory concentration; CC, cytotoxic concentration; SI, selectivity index.


Figure 5. Results of inhibition of SARS-CoV-2 and cell cytotoxicity. IC, inhibitory concentration; CC, cytotoxic concentration; SI, selectivity index; PPAR-γ, peroxisome proliferator-activated receptors-gamma.

실험군으로 쓰인 PPAR-γ agonist 2종 모두 IC50>50, CC50>50, SI=1로 코로나 바이러스 감염 저해 효과는 적고 약물 농도 증가에 따른 세포 독성은 증가하지 않는 것이 확인되었다.

고 찰

본 연구는 COVID-19 치료제를 개발하기 위해 인공지능을 활용하여 세포 실험에 사용할 화합물을 선정하였다는 점에 의의가 있다. 금번 인공지능을 이용해 실험군을 선정하는 데는 약 5주의 시간이 소요되어 기존 방식과 비교하여 시간이 크게 단축되었다. 또한 인공지능 활용 시 네트워크를 통해 누구나 자유롭게 database를 얻을 수 있어 신약 개발이 특정 집단에서만 이루어지던 단점을 보완할 수 있다. 인공지능을 이용하여 COVID-19뿐만 아니라 새로운 질병이 발생했을 때에도 빠르게 치료 약물을 개발할 수 있을 것이다.

세포실험 결과 대조군인 chloroquine, remdesivir, lopinavir는 항바이러스 효과가 확인되었으나 chloroquine, lopinavir는 세포독성도 함께 증가하여 임상에 적용하기에는 제한적이었다. 그에 반해 remdesivir는 FDA에서 COVID-19 치료제로 최초로 승인을 받은 의약품으로, 본 실험에서도 적정 치료 약물 농도에서 세포독성이 증가하지 않아 임상에서 안전함을 확인할 수 있었다.15) 실험군으로 쓰인 PPAR-γ agonist 2종은 세포 독성은 없으나 SI 값이 1로 COVID-19 치료제로서는 한계가 있음을 확인할 수 있었다.

세포 실험을 통해 실험군의 유의미한 결과값을 얻지는 못했으나 COVID-19 치료제로서 새로운 화합물인 PPAR-γ agonist를 감염 세포 모델을 이용하여 치료 효과를 입증하려는 시도를 했다는 데에 본 연구의 의의가 있다. PPAR-γ는 다양한 구조 화합물을 가지며, 본 실험에 사용된 것은 그중 2가지로 다른 구조물의 항바이러스 효과를 확인하지 못해 다른 PPAR-γ의 아형이 치료 효과가 있을 가능성을 배제하지 못하는 한계점이 있다. 또한 세포에 처리된 PPAR-γ agonist의 최고 농도는 50 μM로, 실험 화합물의 적정 치료 농도에 충분히 미치지 못했을 가능성이 있다. 따라서 PPAR-γ agonist를 50 μM보다 고농도로 처리했을 시 SARS-CoV-2 감염 저해 효과가 나타날 수 있는 가능성을 완전히 배제할 수 없다. 이번 실험은 in vitro cell model로 진행하여 생체 내 환경과 차이가 있는 실험 모델로서의 한계점도 있다. 세포 단위에서는 PPAR-γ agonist가 뚜렷한 항바이러스 효과를 나타내지 못했으나 생체 내에서는 사이토카인 폭풍을 억제하여 SARS-CoV-2의 증식을 억제하는 효과를 나타낼 가능성이 있다.

결론적으로 본 연구에서는 인공지능의 RNN screening을 통해 COVID-19 치료 후보군을 선정하고, SARS-CoV-2 감염 세포를 이용해 해당 화합물의 효과를 증명하는 세포 실험을 진행하였다. PPAR-γ agonist 2종은 유의미한 SARS-CoV-2 감염 세포수의 저해 효과가 없고 세포 독성도 증가하지 않아 COVID-19에 효과적인 치료제로 개발되기에는 제한적임을 확인할 수 있었다.

SUPPLEMENTARY MATERIALS
kjfp-11-4-312-appendix.pdf
감사의 글

본 논문의 세포 실험은 한국파스퇴르연구소의 인수공통바이러스연구팀에 의뢰하여 도움을 받았다.

CONFLICT OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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